O Luminol

O Luminol reage com o oxigênio resultante da degradação do 

peróxido de hidrogênio, originando um peróxido 

orgânico muito instável.

• O luminol é um pó de fórmula química (C8H7O2N3 ) descoberto em 1928. Sua aplicação mais famosa é na resolução de crimes, como apresentado em seriados famosos como CSI (Crime Scene Investigation). 

Nessas séries ele é utilizado com frequência na identificação de sangue em cenas de crimes, mesmo que os locais, peças ou roupas tivessem sido lavados posteriormente ao crime.

• Na televisão tudo parece muito simples e exato: os criminalistas aspergem a solução de luminol num local, às vezes aleatório e esperam um pouco, se houver a presença desses fluidos – mesmo que antigos e apagados – as manchas tornam-se azuis, brilhantes e luminosas, facilitando a identificação exata da cena do crime, na extração de DNA e como prova conclusiva da culpa de algum suspeito. 

Na realidade, todo o mecanismo é bem mais complexo: A solução de luminol utilizada na vida real contém também uma base forte, como NaOH e água oxigenada (H2O2). 

• Essas 3 substâncias juntas reagem, formando o ânion de um composto chamado 3- aminoftalato que emite luz naturalmente, no entanto a reação só é forte o suficiente se for catalisada por um metal, no caso, os átomos de ferro encontrados nas proteínas do sangue, daí a identificação de manchas de sangue.

A luz é emitida porque o 3-aminoftalato é produzido inicialmente num estado excitado, ou seja, por algum motivo estrutural seus elétrons armazenam energia além do natural. 

• A tendência é o composto eliminar a energia sobressalente movimentando seus elétrons para camadas mais internas, ocorre que a cada mudança de orbital um fóton (uma partícula de energia) é liberado até que o composto se estabilize. 

Cada fóton de cada elétron excitado de cada molécula de 3-aminoftalato, em conjunto, formam uma onda com um comprimento aproximado de 430 nm que aos nossos olhos é de um brilho azulado.

• A luminescência, um termo geral utilizado para designar diversos processos de emissão de luz, é um fenômeno bastante instigante e estudado desde os tempos mais remotos. 

Ocorre quando elétrons excitados após a absorção de uma determinada quantidade de energia emitem radiação luminosa ao retornarem ao seu estado fundamental, sem que uma parte significativa dessa energia se perca, se dissipando na forma de calor (DIAS, 2001; MENEZES, 2010). 

• Essa energia eletromagnética é emitida por moléculas que possuem comprimento de onda na região localizada entre o infravermelho (800 nm) e o ultravioleta (400 nm) no conhecido espectro eletromagnético (SANTOS; SANTOS; COSTA, 1992; FERREIRA; ROSSI, 2002). 

A quimioluminescência, de acordo com Leite et al. (2004) é um subtipo de luminescência em que a energia de excitação do elétron para a produção da radiação luminosa advém de uma reação química, ou seja, a produção de luz ocorre devido a quebra de ligações ricas em energia já existentes na molécula que reage ou formadas a partir de rearranjos moleculares (intermediários da reação). 

• O tempo da reação quimioluminescente e a duração da emissão da radiação são variáveis de acordo com a natureza do material que a emite e, de acordo com Ferreira; Rossi (2002) variam de períodos muito pequenos (menores que 1 s) até muito longos (cerca de 1 dia).

A quimioluminescência tem sido amplamente utilizada em diversos tipos de ensaios laboratoriais, destacando-se nas últimas décadas na criminalística com a utilização de compostos que produzem reações quimioluminescentes instantâneas ao entrarem em contato com tecidos biológicos que podem ser facilmente encontrados em locais nos quais um crime contra a pessoa tenha sido praticado como sêmen e, principalmente,sangue.

• O luminol é um composto que possui poderosas propriedades quimioluminescentes mediante oxidação que são caracterizadas pela emissão de luz azulada (MENEZES, 2010). De acordo com Navarrete et al. (2005), a quimioluminescência do luminol em meio aquoso básico, ocorre em presença de um reagente oxidante (H2O2, O2, HOCl) e,normalmente, de um metal de transição ou certos íons inorgânicos. 

Ele é amplamente utilizado em todo o mundo para testar a presença de sangue, uma vez que, o grupo heme, mesmo em quantidades mínimas, também é capaz de catalisar sua oxidação em solução alcalina (GROSS; HARRIS; KALDUM, 1999; LEITE; FATIBELLO-FILHO; ROCHA, 2004; BARNI et al, 2007).

• Não obstante, em um local de crime os vestígios nem sempre estão evidentes. Fatores ambientais e, principalmente, manipulações intencionais influenciam em seu estado de conservação (PITARCH et al., 2010), o que pode dificultar e muito a sua localização e identificação, ou mesmo uma coleta para posteriores análises laboratoriais que serão valiosas no eventual processo criminal que seguirá a fase de investigação. 

A aplicação da quimioluminescência em criminalística vem ganhando popularidade nas últimas décadas, inclusive com ampla divulgação pela mídia, tanto em jornalismo informativo quanto em seriados policiais televisivos de grande sucesso, que destacam a utilização do reagente luminol para a comprovação da presença de sangue em locais de crime, em supostas armas utilizadas para cometê-los, roupas de pessoas suspeitas, entre diversos outros itens relacionados ao fato delitivo, mesmo depois de limpos e lavados.

• Luminol é uma substância química criada em 1928 por H. O. Albrecht. É um produto que é preparado misturando-se o luminol propriamente dito, com uma substância à base de peróxido de Hidrogênio (água oxigenada), que reage muito lentamente. 

Quando essa mistura entra em contato com o sangue humano, utiliza o ferro presente na hemoglobina como agente catalisador causando uma reação de quimiluminescência. 

Cena de Crime

Luminol obtenção e ação:

• O luminol (5-amino-2,3-diidroftalazina-1,4-diona) é um reagente mundialmente conhecido por suas propriedades quimioluminescentes e é popular pela eficácia na detecção de sangue (MONTEIRO, 2010), muito bem caracterizada pela imediata emissão de luz azul ao entrar em contato com o referido tecido. 

Ele foi sintetizado pela primeira vez pelo químico alemão H. O. Albrecht, em 1928 e foi o primeiro composto a ser utilizado para a identificação de manchas de sangue, em meados dos anos 30 do século passado (MENEZES, 2010; MONTEIRO, 2010). 

• Atualmente, um dos principais métodos para a sua obtenção é por meio da reação da hidrazina com o ácido 3-nitroftálico, mediante aquecimento (CHEMELLO, 2007), com a posterior redução do grupamento nitro do 5-nitroftalhidrazina para a formação do produto final.

Existem diversos mecanismos propostos por autores distintos para explicar a reação quimioluminescente do luminol, e a maior parte das etapas mecanísticas já está elucidada e é bem compreendida, contudo ainda restam alguns detalhes sob discussão, como a formação de estados intermediários eletronicamente excitados (FERREIRA; ROSSI, 2002). 

• Explorar esse ponto. A reação, para ocorrer, necessita de um agente oxidante – o mais comumente utilizado é o peróxido de hidrogênio – e um catalisador – utiliza-se normalmente um metal de transição. Pode ser realizada em alguns tipos de solventes orgânicos, como o dimetilssulfóxido, ou em soluções aquosas com boa resposta, mas sua eficiência ótima ocorre em meio básico (DIAS, 2001; ALMEIDA, 2009).

No mecanismo mais provável aventado para descrever a reação mais simples do luminol em meio aquoso, um metal de transição que age como catalisador realiza a conversão do luminol (1) em diazoquinona (2). A diazoquinona é então atacada pelo ânion proveniente do peróxido de hidrogênio hidrolisado, formando um endoperóxido (3); este perde uma molécula de nitrogênio (N2) e forma então o diânion do ácido 3-aminoftálico (4), que já é produzido no estado excitado. Essa é a espécie que sofrerá decaimento, gerando a quimioluminescência por meio da emissão de luz em 431nm quando o elétron excitado pela reação retorna ao seu estado fundamental (5) (DIAS, 2001; MARQUETTE; BLUM, 2006).

• O luminol é eficaz para detectar sangue, mesmo depois de lavado diversas vezes (PONCE et al, 2002) devido ao fato de que, presente nas hemácias, está a hemoglobina que contém íons de ferro em seu grupo heme e agem como o catalisador necessário para desencadear a reação quimioluminescente do luminol (FERREIRA; ROSSI, 2002). 

Quando ainda se encontra dentro do organismo, a hemoglobina permanece protegida pelos eritrócitos que possuem mecanismos (enzimáticos e não enzimáticos) para evitar sua desnaturação, mantendo os íons ferro na forma Fe2+. 

• Ao deixar o corpo, o sangue passa a estar exposto a uma série de processos degradativos, passando por hemólises e reações de oxirredução catalisadas em um primeiro momento por enzimas de sua própria estrutura celular e, também, por aquelas presentes em microrganismos que se encontram no ambiente (BARNI et al, 2007). 

Sob tais condições, ocorre então a degradação da porção polipeptídica da hemoglobina, e a oxidação do íon ferroso (Fe2+) passa a acontecer de forma espontânea, com a conversão da hemoglobina a metahemoglobina e, em meio alcalino, este íon passa a coordenar-se com grupos hidroxila em substituição ao O2, que anteriormente ligava-se ao Fe2+ (ALMEIDA, 2009).

• Esse novo grupo prostético heme composto por íons férricos em que as moléculas de oxigênio estão sendo substituídas por hidroxilas é chamado hematina (ferroprotoporfirina) e o ciclo catalítico da reação luminol/sangue no mecanismo proposto por Maloney e Thornton em 1985 (ALMEIDA, 2009) é iniciado e finalizado por ele: ao borrifar o reagente sobre uma mancha de sangue, os grupamentos heme férricos (Fe3+) perdem mais um elétron e vão para um novo estado de oxidação, formando dessa forma intermediários instáveis contendo Fe4+, que então catalisam sua oxidação, produzindo assim a luminescência, enquanto são reduzidos novamente a Fe3+ (BARNI et al, 2007).

Existem algumas outras proposições para descrever o mecanismo, no entanto esta ainda permanece como a mais aceita atualmente.

• Uma das maiores preocupações com relação à utilização dos testes de presunção é que os componentes aplicados sobre o material estudado danifiquem sua estrutura de alguma forma e prejudiquem análises laboratoriais, como a extração de DNA, que é de extrema importância para a atividade pericial.

Com o intuito de verificar a ocorrência desse fato, alguns estudos foram realizados utilizando vários tipos de reagentes utilizados em testes presuntivos. Um desses experimentos foi publicado por Ponce e colaboradores em 2002, com a intenção de verificar uma possível interferência do luminol em posteriores extrações e amplificações de DNA.

• O experimento foi conduzido com tecidos brancos de algodão manchados de sangue seco a temperatura ambiente. Os tecidos foram lavados com detergente padrão em lavadora, a 30 oC e secos ao ar livre. Uma das amostras foi testada com luminol e outra foi armazenada para realizar as amplificações de DNA por PCR.

O tecido testado com luminol foi lavado, seco e testado com o reagente novamente até que se obtivesse um resultado negativo para a luminescência, o que só ocorreu após a décima primeira lavagem. Após cada lavagem foi realizada a extração do DNA, cuja resposta foi ainda positiva até a terceira lavagem.

• Essa pesquisa indicou que não existem diferenças entre os resultados de amplificação de amostras sem o tratamento prévio com o luminol e aquelas que foram testadas com o reagente (PONCE et al, 2002), o que demonstra que o luminol não interfere na análise de DNA por PCR.

A perícia científica:

• É crescente o papel que a ciência desempenha nas investigações criminais (RODRIGUES; SILVA; TRUZZI, 2010).

Com a legislação a cada dia mais voltada à proteção dos direitos humanos, deve-se salvaguardar a integridade física humana não se concebendo ao profissional de polícia moderno a obtenção de uma confissão de um agravo por parte de um eventual suspeito por meios insidiosos ou cruéis.

• Dessa forma, torna-se necessário que as técnicas utilizadas para a comprovação do fato em questão enveredassem ainda mais pelo caminho da ciência e da tecnologia, utilizando métodos rigorosos e que forneçam resultados tão precisos quanto possíveis, sob pena de não terem valia perante o tribunal caso os vestígios coletados no local de crime durante a investigação não sejam tratados adequadamente (DUARTE, 2010).

Nesse sentido, as mais importantes descobertas do mundo científico são aplicadas em criminalística para elucidar toda espécie de delito.

• Crimes mais violentos, como homicídio, por exemplo, costumam apresentar sinais evidentes e, em muitos casos, pode não ser difícil para o perito realizar a identificação e coleta de indícios no local, como pegadas ou sangue.

Contudo, com o decorrer do tempo, tais vestígios, principalmente os biológicos, podem perder propriedades importantes para confiabilidade dos testes que serão realizados para fins forenses, seja por fatores ambientais aos quais eventualmente estejam expostos até o momento em que são encontrados, ou pela manipulação humana, com a intenção de limpá-los para que o fato ocorrido seja encoberto (PITARCH et al, 2010).

• Dentre os vários tipos de vestígios encontrados em locais onde ocorreu um crime, os hematoides são os mais comuns.

Sensibilidade e limitações:

• A sensibilidade de técnicas quimioluminescentes como esta é bastante elevada, podendo chegar a limites de detecção na ordem de fentomol (10-15 mol) não são incomuns nas técnicas de quimioluminescência e em alguns sistemas enzimáticos já foram detectadas cerca de 120 moléculas, conforme esclarecem Ferreira; Rossi (2002).

O luminol opera com limites de detecção muito pequenos, e é capaz de indicar a presença do analito, nesse caso, sangue, em concentrações extremamente pequenas. Existem estudos que apontam sua eficácia para a detecção de sangue em superfícies submetidas a até dez lavagens (PONCE et al, 2002) demonstrando, dessa forma, o alto grau de sensibilidade do teste, descrito na literatura como 1:5.000.000 em tecidos de algodão e 1:100.000 em superfícies que não sejam absorventes (ALMEIDA, 2009).

• Uma das limitações que o reagente apresenta é que, devido à sua labilidade, deve ser preparado no momento da utilização e deve ser mantido sob refrigeração para que suas propriedades sejam preservadas e a confiabilidade do teste mantida. 

Isso acarreta uma dificuldade em transportar o material até o local onde será empregado, por existir a necessidade da manipulação in loco, além de aumentar o custo para a sua utilização (ALMEIDA, 2009).

• A baixa especificidade também pode ser apontada como uma limitação do luminol, a ser considerada grave, uma vez que, pode induzir a resultados falso-positivos com íons metálicos como ferro, cromo ou cobalto, que catalisam a reação e desencadeiam a emissão de luz pelo reagente, além de peroxidases de vegetais e outros tipos de agentes oxidantes fortes que também reagem com o composto e geram a emissão de luz (CREAMER et al, 2003).

Superfícies limpas com alvejantes igualmente podem apresentar alguma interferência, pois o hipoclorito presente na maior parte dos alvejantes domésticos também pode levar à produção de resultados positivos ilusórios.

• Contudo, pesquisas demonstraram que a luminescência gerada pelo hipoclorito não possui o mesmo comprimento de onda (430 ± 3 nm) daquela gerada pelo grupo heme do sangue (455 ± 2 nm) e o tempo de duração da emissão de luz e sua forma de extinção não são compatíveis, uma vez que, a luminescência produzida pelo sangue decresce com o passar do tempo, enquanto aquela advinda do hipoclorito dissipa-se da superfície em que se encontra (CREAMER et al, 2003).

É necessária muita atenção e experiência ao cientista forense para diferenciar essas emissões, que se tornam ainda mais semelhantes quando vistas em fotografia, o que é necessário ao procedimento de investigação. Dessa forma, existem estudos e técnicas adequadas para que essa interferência seja eliminada, diminuindo assim o risco de erro na análise devido a esse fator (KENT; ELLIOT; MISKELLY, 2003).

• Os alvejantes contêm estabilizantes voláteis em sua formulação, que acabam por evaporar com o passar do tempo; dessa forma, a quimioluminescência provocada pelo hipoclorito já não é mais um interferente após 8 h da aplicação do alvejante na superfície estudada (CEAMER et al, 2005), ou também é possível evitar tal interferência por meio da adição de aminas primárias e secundárias ao preparar o reagente, pois elas apresentam a propriedade de inibir a quimioluminescência oxidativa do luminol causada pelo hipoclorito.

Deve-se, no entanto, ter atenção, pois já foi demonstrado que aminas terciárias causam o efeito inverso: aumentam a produção da luminescência e a via catalítica mais provável e aceita para a ocorrência deste fato é a formação de íons clorotrialquilamônio, que atuariam como oxidantes (KENT; ELLIOT; MISKELLY, 2003).

• A reação entre as aminas e o hipoclorito depende do pH do meio e da basicidade da amina, pois quanto mais básica ela for, mais competitiva será pelo hipoclorito frente ao luminol, não deixando que ele reaja com este último (KENT; ELLIOT; MISKELLY, 2003)

A literatura descreve o preparo do reagente com 0,05 mol/L de glicina (C2H5NO2), que é apontada como uma boa amina para impedir a oxidação do luminol pelo hipoclorito (ALMEIDA, 2009). 

• A exposição do resíduo hemático a fatores ambientais também influencia de maneira substancial no resultado dos testes de presunção. Vestígios submetidos a condições adversas, como enterrados ou submersos em água ou, simplesmente o decorrer do tempo,podem fazer com que esses testes já não apresentem a eficácia inicialmente esperada. 

É sabido que a efetividade do luminol para indicar a presença de sangue em vestígios dessa natureza ainda é alta, tornando-o o reagente mais indicado para testar amostras envelhecidas ou que se apresentem em mau estado de conservação (PITAR et al, 2010). 

• Estudos recentes apontam sua capacidade de detectar traços de sangue depositado no solo após seis anos de exposição ao ar livre. Este experimento foi iniciado no ano de 2004, com os pesquisadores marcando um X com sangue no chão, deixado sob as condições locais e testado com luminol a cada dois meses para verificar o tempo de permanência de vestígios; e finalizado em 2010 quando ainda era possível perceber traços hemáticos no local com a aplicação do reagente (GABEL; SHIMAMOTO; STENE; ADAIR, 2011). 

Este resultado demonstra, mais uma vez, que os métodos quimioluminescentes de análise forense, dos quais o luminol é o principal, são extremamente eficazes para indicar a presença de sangue após um período longo, por apresentar sensibilidade bastante elevada, sendo capaz de reagir mesmo com quantidades ínfimas de analito, como no caso da referida pesquisa. 

O luminol por ser uma reação química pode destruir 

outras evidências  na cena do crime.